工程微生物在生物制造、疾病治療、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊應(yīng)用前景，但其在環(huán)境中的潛在擴(kuò)散風(fēng)險也引發(fā)了生物安全方面的擔(dān)憂。因此，亟需發(fā)展穩(wěn)定、可靠的生物封控技術(shù)予以應(yīng)對。目前，基于CRISPR-Cas系統(tǒng)構(gòu)建的“自殺開關(guān)”雖可用于工程菌封控，但其在長期培養(yǎng)和強(qiáng)選擇壓力下，易因基因突變導(dǎo)致功能失效、出現(xiàn)逃逸細(xì)胞，進(jìn)而制約了該技術(shù)的實際應(yīng)用。

　　近日，中國科學(xué)院微生物研究所研究團(tuán)隊在工程菌生物安全控制領(lǐng)域取得進(jìn)展。研究團(tuán)隊提出將毒素—抗毒素模塊與CRISPR-Cas系統(tǒng)偶聯(lián)的生物封控新策略——ATTACH，并構(gòu)建了具有遺傳穩(wěn)定性的雙層生物安全開關(guān)，為工程微生物的安全應(yīng)用提供了新思路。

　　研究團(tuán)隊基于前期在CRISPR護(hù)衛(wèi)系統(tǒng)CreTA方面的原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)，設(shè)計并構(gòu)建了生物封控系統(tǒng)ATTACH。該系統(tǒng)采用“雙保險”機(jī)制進(jìn)行封控：一方面，CRISPR-Cas系統(tǒng)作為主要殺傷模塊，在誘導(dǎo)條件下通過Cas3介導(dǎo)的染色體大規(guī)模降解，快速殺滅工程菌；另一方面，當(dāng)CRISPR效應(yīng)蛋白基因突變或蛋白失活時，毒素—抗毒素模塊釋放毒素并觸發(fā)細(xì)胞死亡，從而清除逃逸細(xì)胞，明顯提高了封控系統(tǒng)的穩(wěn)定性和效率。

　　團(tuán)隊進(jìn)一步通過優(yōu)化迭代，構(gòu)建了無需抗生素篩選標(biāo)記的ATTACH3，并在益生菌Nissle 1917中進(jìn)行了評估。在小鼠腸道模型中，經(jīng)ATTACH系統(tǒng)誘導(dǎo)168小時后，工程菌逃逸率接近10?9，超出美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）推薦的生物安全標(biāo)準(zhǔn)（10?8）約10倍。應(yīng)用研究表明，該系統(tǒng)對工程菌生長及番茄紅素（抗氧化劑）的合成產(chǎn)量均無明顯影響，并在多種細(xì)菌中展現(xiàn)出跨物種“即插即用”特性。

　　該研究為益生菌及其他工程微生物的安全應(yīng)用提供了重要技術(shù)支撐。

　　相關(guān)研究成果發(fā)表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上。研究工作得到國家自然科學(xué)基金委員會、科學(xué)技術(shù)部、中國科學(xué)院的支持。

基于CRISPR偶聯(lián)毒素—抗毒素系統(tǒng)開發(fā)的生物封控技術(shù)ATTACH