近期，中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心開發(fā)了創(chuàng)新的、基于可重復(fù)利用靶點的大片段DNA染色體整合策略，構(gòu)建了首株能夠脫離質(zhì)粒、穩(wěn)定合成紅霉素A的大腸桿菌菌株，并提升了產(chǎn)量。

　　紅霉素是臨床重要的廣譜大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。傳統(tǒng)研究多采用多質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，但質(zhì)粒的不穩(wěn)定性、抗生素的使用及細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)過重，限制了生產(chǎn)效率提升。為了解決這一難題，該研究開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的可重復(fù)利用靶點工具包。

　　這一工具包針對不同長度的片段采取了差異化策略。對于大于10 kb的片段，采用兩步整合法，利用限制性內(nèi)切酶從質(zhì)粒直接切割大片段作為供體DNA，避免了長片段PCR引入突變的風(fēng)險；對于小于5 kb的片段，采用迭代整合法，在同一靶點進(jìn)行連續(xù)組裝。通過該技術(shù)，研究將23個紅霉素合成相關(guān)基因，精確集成到大腸桿菌BAP1的染色體上，獲得了工程菌株sZG9，這是全球首個實現(xiàn)無質(zhì)粒紅霉素A生物合成的大腸桿菌菌株。在實現(xiàn)染色體穩(wěn)定集成后，研究進(jìn)一步針對紅霉素合成中的前體供應(yīng)瓶頸，進(jìn)行了深度的代謝工程優(yōu)化。經(jīng)過多輪迭代優(yōu)化，菌株sZG135的紅霉素A產(chǎn)量達(dá)到9.80 mg/L，較初始菌株實現(xiàn)了8.25倍的增長，刷新了目前大腸桿菌合成紅霉素A的最高產(chǎn)量紀(jì)錄。

　　上述研究為紅霉素的高效生產(chǎn)提供了高性能的底盤細(xì)胞，其開發(fā)的大片段DNA染色體整合策略具有通用性，可推廣至其他復(fù)雜聚酮類、萜類等天然產(chǎn)物的生物合成研究，為合成生物學(xué)研究提供了工具支持。

　　相關(guān)研究成果在線發(fā)表在《生物資源技術(shù)》（Bioresource Technology）上。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃和國家自然科學(xué)基金等的支持。

可復(fù)用靶位點工具包助力大片段DNA染色體整合并提升紅霉素在大腸桿菌中的產(chǎn)量